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Afiches Enfermedades Emergentes y Zoonóticas de Panamá

A­51 DESARROLLO DE UNA RT­QPCR MULTIPLEX
PARA DETECTAR VIRUS ZIKA Y CHIKUNGUNYA EN
MOSQUITOS AEDES SPP.

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B Henríquez , L Saenz , A Valderrama S López­Vergès y F Samudio 3
A­51 1 Departamento de Investigación en Entomología Médica, Departamento de
2
Investigación en Virología y Biotecnología, y Departamento de Investigación en
3
Parasitología, ICGES, Panamá.
La amenaza mundial a la salud pública por la propagación de arbovirus como
Chikungunya y Zika aumenta la necesidad de mejores planes de vigilancia,
como la detección temprana de virus transmitidos por mosquitos que co­circulan
dentro del mismo vector en Panamá. Es importante implementar herramientas
moleculares sensibles­específicas capaces de detectar cargas virales muy bajas
en mosquitos capturados en campo. Hemos desarrollado un RT­qPCR basado
en la amplificación específica del gen de la ARN polimerasa del virus
Chikungunya (NSP4) y del virus Zika (NSP5), mediante la obtención y análisis
de todos los genomas completos de ZIKV y CHIKV de américa disponibles en el
GenBank. En ambos ensayos se establecieron condiciones independientes, por
RT­qPCR utilizando SYBR Green y siguiendo los lineamientos de información
mínima para la publicación de experimentos de qPCR (MIQE). Los ensayos in­
silico de inclusividad/exclusividad indicaron especificidad; confirmándose tanto
por RT­PCR convencional como por secuenciación de los amplicones obtenidos
de 175 pb y 164 pb que mostraron temperaturas de melting promedio de 81° C y
80° C para los primers de ZIKV y CHIKV, respectivamente. No se detectaron
dímeros de primers ni productos inespecíficos o cambios de Ct en la reacción o
en la curva de melting durante los ensayos individuales de RT­qPCR. Se
diseñaron sondas específicas Taqman a través del software primer3 y
realizamos un ensayo Taqman utilizando los primers previamente probados con
SYBR Green, cuyas características se evaluaron in­silico (software Primer­
BLAST). Los resultados in silico señalan que ambos ensayos Taqman detectan
específicamente cada virus, y las sondas no hibridan con ningún gen
inespecífico o genes de la ARN polimerasa de otros virus relacionados como el
Dengue. También se realizaron constructos plasmidiales de cada producto para
verificar el Límite de detección (LOD), detectándose en cada caso de 1 a 1x108
copias (Taqman). Ensayos como HRM, gradientes de concentración de
magnesio, transcripción in vitro se están realizando para evaluar la sensibilidad
de ambas metodologías (SYBR Green/Taqman), o en RT­qPCR multiplex para
detectar y cuantificar la carga viral de ambos virus en mosquitos Aedes spp.

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